HEK293 的世界
1 HEK293细胞的来源
HEK293细胞，又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点。1973年，荷兰莱顿大学的Alex Van Der Eb和他的团队从一个夭折的人类胚胎肾中分离并培养了这种细胞，其中一位博士后Frank Graham通过转染了Ad5 E1A/B基因到该293细胞中，细胞命名中的数字可以追溯到他的第293次实验产生的原始细胞克隆这一事实。由于存在Ad5 E1A/B基因的存在，HEK293常用于生产腺病毒载体和腺相关病毒载体。同时由于其易维护和稳健性，快速生长和转染效率高的特点被广泛用于重组蛋白的表达。
2 HEK293细胞的家族
图1 HEK293 细胞家族
通过基因改造及驯化等，HEK293细胞家族有超过10种细胞系。目前国内最常用的HEK293细胞系是293T和293F.
在原始293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株，即为293T细胞系。这使得包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。
293T细胞除了可用于各类基因表达及蛋白生产外，目前主要被用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产，如腺病毒及其他哺乳动物病毒。但该细胞原始属于贴壁性细胞，不太适合大规模工业化应用，因此很多企业对其进行悬浮驯化。悬浮驯化成功后其病毒的表达效率显著下降，并且悬浮培养时容易结团。
293F细胞是一类可以在无血清培养体系快速生长的野生型293细胞系，同时可以高效表达蛋白，这里的F来自于Fast-growth一词。293FT细胞是由293F细胞导入pCMVSPORT6TAg.Neo质粒获得，常用于慢病毒载体的生产。293FTM细胞是由Flp-InTM T-RExTM 293细胞导入单嗜性（ecotropic）报告质粒和MAPPIT (mammalian protein-protein interaction trap) 报告质粒获得，常用于蛋白互作筛选。
3 293瞬转的方法和原理
3.1 生物学方法
生物学方法一般是利用病毒载体将目的基因转入宿主细胞中，目前常用的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。
（1）慢病毒和逆转录病毒：慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。逆转录病毒载体提供的最重要的优势是它们能够将其单链RNA基因组转化为双链DNA分子，稳定地整合到目标细胞基因组中，从而达到持久性表达。
（2）腺病毒及腺相关病毒：腺病毒的病毒粒是一种无包膜的二十面体颗粒，大小约为70-90nm，外层蛋白质外壳包裹着内部核蛋白核心[23]。腺病毒载体有许多优点，如它们感染有丝分裂后的细胞，效率高且病毒滴度高等。
3.2 物理方法
物理方法可以利用多种物理工具传递遗传物质，主要包括电穿孔方法，基因枪法，显微注射法等。
（1）电穿孔法：电穿孔是将细胞置于高压电场下，导致细胞膜暂时破裂，并形成足够大的孔隙，允许大分子（以及ATP等较小分子）进入或离开细胞。但是电转染时细胞容易成团、死亡率高，电转之后细胞需要较长的时间恢复，并且单次电转的细胞密度比较低，这些缺点限制了电穿孔法在瞬转表达中的使用。
（2）其他方法：基因枪法，是用压缩气体（氦或氮等）产生冷的气体冲击波进入轰击室，把粘有DNA的细微金粉打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移。他的优势是只需要少量的DNA和细胞，就能输送大片段DNA。这种方法简单、快速、灵活，但只有很少部分的细胞符合这样的要求，大多数会因为力度不合适而失败。
显微注射法是一种通过将微小移液管插入活细胞中以达到递送生物材料目的的方法，广泛应用于生物医学中，如将核酸直接注射到细胞质或细胞核中。显微注射法在单细胞转染中具有独特的优势，包括成本低，适用于不同的细胞类型和注射物，以及其无病毒性质，安全性高。
3.3 化学转染方法 常用的化学转染的方法主要是磷酸钙与DNA的共沉淀法，还有以阳离子复合物作为DNA载体进行瞬转。
（1）磷酸钙共沉淀法：磷酸钙共沉淀法比电穿孔法劳动强度小得多，适合大规模细胞瞬转表达。这种方法的缺点是此方法不适合在没有血清的情况下转染细胞，游离的磷酸钙会诱导DNA进一步沉淀，导致严重的细胞毒性。
（2）阳离子聚合物：阳离子复合物不局限于它们所携带的遗传物质的大小或类型，它们可以传递大质粒（pDNA），信使RNA （mRNA）以及小干扰RNA （siRNA）。聚乙烯亚胺（PEI）和聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯（pDMAEMA）是两类被广泛研究的阳离子聚合物。高阳离子多聚物通过与表面蛋白聚糖相互作用进入细胞，然后通过内吞作用内化。
PEI是最突出和广泛使用的阳离子聚合物，其可质子化氨基可与带负电荷的生物分子（包括药物和核酸）发生静电相互作用，形成聚电解质复合物。具有高摩尔质量和高度支化的PEI可形成具有高转染效率的酶促稳定的小聚复合物。然而，它们的不可降解性、细胞毒性和低血液相容性限制了它们在治疗方向的应用。但最近的研究表明PEI在许多细胞系中具有较高的基因转移能力，同时显示低细胞毒性。
4 瞬转的优化
瞬转的优化通常需要考虑：质粒载体的优化、细胞培养基的优化、瞬转工艺和培养工艺的优化。
4.1 质粒载体的优化
动物细胞表达质粒的构成一般包括启动子元件、增强子元件、加poly(A）信号以及用于复制和选择的元件。
Durocher等人将来自pAdCMV5的编码CMV5-poly（A）表达框的BglII片段连接到BglII线性化的pCEP4中，产生了新的载体pCEP5，并通过该载体使分泌型碱性磷酸酶（secretory alkaline phosphatase, SEAP）表达量提高了10倍。
4.2培养基优化
培养基的成分复杂，对HEK293细胞的生长及表达有显著的影响，一款好的培养基是保证瞬转高效的重要因素。
（1）微量金属离子：微量金属与超过1000种蛋白质相关，一些微量元素，比如硒、锌和铜已被广泛研究。硒通过参与谷胱甘肽氧化反应来抗氧化。锌参与细胞分化、凋亡和细胞增殖。缺乏锌的大鼠胶质瘤细胞生长速度下降，补充锌后生长速度恢复。锌可以通过保护细胞免受自由基损伤来促进细胞活力，并已被证明可以抑制Caspase-3依赖性凋亡。铜在多种重要酶中发挥着作用，包括细胞色素c氧化酶、酪氨酸酶、对羟基苯丙酮酸水解酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酸氧化酶和铜/锌超氧化酶歧化酶（SOD），这些酶参与了细胞生长和维持的过程。缺铜会降低细胞产生SOD的能力，从而降低细胞的抗氧化防御能力，从而增加细胞对氧化性DNA损伤的易感性。
（2）其他因子的添加：一些化合物也显示出对瞬转表达的积极影响。这些转染增强剂要么促进PEI/DNA转染复合物进入细胞或细胞核，要么增加基因表达水平。有研究表明在无血清悬浮培养的HEK293细胞中添加20 mmol/L醋酸锂、3.36 mmol/L丙戊酸和5.04 mmol/L咖啡因后用PEI介导进行瞬时转染，病毒样颗粒（VLPs）产量增加3.8倍，同时保持细胞培养活力在94%。 当在转染后3h后添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂时，HEK293E细胞的瞬时抗体产量增加了4-5倍以上，结合丙戊酸处理和低温培养，重组抗体产量从40mg/L提升至超过90mg/L[61]。
乙醇胺、腐胺、脂质混合物、氯化胆碱、d-泛酸钙和丙酮酸钠可能对细胞生长有促进作用。然而，其他物质，如亚硒酸钠、抗坏血酸、谷胱甘肽、核黄素和肌醇，被认为是抑制细胞生长的物质。
4.3 瞬转工艺的优化
瞬转试剂、细胞密度、DNA浓度、PEI与DNA的比例等都会对瞬转效率有很大的影响。
由于瞬时表达不整合到细胞染色体上,理论上来说起始的细胞浓度高会使得蛋白的表达量高,但细胞吸收DNA有一定的饱和性。DNA与PEI比例影响DNA/PEI复合物的性质,进而影响其进入细胞的途径。一般认为,在PEI比例较高的情况下,DNA/PEI复合物的结构更加紧密,并且可提高复合物的正电性,使其更容易进入细胞内,可避免复合物在细胞溶酶体内的降解，但PEI较高有一定的细胞毒性，影响细胞活率。
Thompson等人对细胞密度4-18×106的范围进行瞬时转染的研究，结果表明低细胞密度导致游离PEI浓度变高，增加了对细胞的毒性，导致细胞活率产物产量降低。高度富集的培养基配方和更高性能的转染试剂支持在2.5×106个/mL的培养密度下转染，结果蛋白产量比当前使用1×106个/mL的瞬时表达系统高2-10倍。
4.4培养工艺优化
优化培养条件是提高HEK293瞬转表达的重要方法。通常包括培养温度、补料工艺等方法。
（1）温度对于瞬转的影响： HEK293细胞，通常在37℃培养，将培养温度降至33℃，降低温度可以提高细胞活率，延长培养时间，同时也能降低DNA的降解速率，从而提高蛋白的表达。
（2）补料对于瞬转的影响: 对比HEK 293 EBNA1细胞补料分批培养与批培养，补料分批培养比批培养的重组蛋白总产量增加了165%。Kiseljak 等人通过补料分批培养将 HEK293EBNA 大规模瞬时转染表达重组蛋白产量提高到2g/L。Napoleone等人通过对补料工艺优化，HEK293细胞密度达到20×106个/mL，抗体滴度比相应批次培养高3倍。
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