NK 细胞简化高效扩增试剂盒说明书

产品介绍

新鲜脐带血/成人外周血培养方案（2.5L体系）

【产品介绍】 

1. NK 试剂盒通用于脐带血及健康人外周血 NK 细胞培养； 

2. 组分采用药用级激活抗体组合，化学成分明确，无异源成分，无滋养层细胞； 

3. 试剂盒组合仅 3 支试剂，无需包被步骤，无繁杂配制流程及易混淆步骤； 

4. 扩增能力强，以单个核细胞为样本，无需前期分选工作； 

5. cGMP 标准下，采用一次性生产工艺，保证产品稳定性、一致性。 



新鲜脐带血 CBMC 初始投入方案 

脐带血中 NK 细胞（CD3- 56+ 16+）占淋巴细胞比例约为 3%-5%之间，其比例远远低于 成年人外周血。

而 NK 的细胞原始比例是体外培养的关键因素，当 NK 细胞原始比例低于 5%，会显著减缓体外活化及增殖速率。 

一般 200ml 规格采血袋内含 28-30ml 抗凝剂，建议采集脐带血量为 100ml 以上（除去抗 凝剂体积）。

可获得 CBMC 约 2 亿-3 亿之间。 建议客户在实验开始前，将采集的脐带血留出 1ml 进行流式检测，记录 NK 细胞比例 （CD3- 56+ 16+）、细胞数量、细胞活率。

并参照下表进行初始细胞投入。






新鲜脐血差异影响 NK 细胞体外活化增殖的因素 

1. NK 细胞在新鲜脐带血中的原始比例：其占比越高增殖及活化效果越好； 

2. 细胞活率：细胞活率越高增殖及活化效果越好； 

3. 健康状况：未用药、无急慢性病产妇其培养效果佳； 长期用药、放化疗或使用过免疫系统类药物的人群培养结果波动性较大。

新鲜成人外周血 PBMC 细胞初始投入方案 




由于不同个体外周血原始 NK 细胞数量占淋巴细胞数量比例差异性较大（健康成年人 NK 细胞占淋巴细胞比例约为 5%-15%之间）。推荐采集外周血量为 50-70ml（除去抗凝剂 体积）。可获得 PBMC 约 6 千万-1.5 亿之间。 建议客户在实验开始前，将采集的外周血留出 1ml 进行流式检测，记录 NK 细胞比例 （CD3- 56+ 16+）、细胞数量、细胞活率。并参照下表进行初始细胞投入。






个体差异影响 NK 细胞体外活化增殖的因素 

1. NK 细胞在外周血中的原始比例：其占比越高增殖及活化效果越好； 

2. 年龄：健康人在 18-65 岁范围内，年龄越小培养效果越好。大于 65 岁人群其培养结果波 动性较大。 

3. 健康状况：未用药、无急慢性病人群其培养效果佳； 长期用药、放化疗或使用过免疫系统类药物的人群培养结果波动性较大。

NK 活化及培养流程（2.5L 体系） 

第一部分 培养基的配制 

▷ 活化培养基的配制 

1. DAY0 需使用未加入任何因子的基础培养基，请于 DAY0 操作流程完成后配制活化 培养基。 

2. 本套装包含一瓶 500ml 免疫细胞无血清培养基（活化）（产品货号：YYT01.05），加入 1 整支 NK-2 摇匀即为 500ml 活化培养基。使用时现用现配，活化培养基可在 4℃环境下 保存 20 天左右。 

▷ 增殖培养基的配制 

本套装包含两瓶 1L 免疫细胞无血清培养基（产品货号：YYT01.001），加入 500ul NK-3 摇匀即为增殖培养基。

使用时现用现配，增殖培养基可在 4℃环境下保存 20 天左右。

先使用第一瓶，用完后再配制第二瓶。 

1. 第一瓶：1L 免疫细胞无血清培养基中加入 500ul NK-3。（剩余 500ul NK-3 置于 4℃ 环境保存，最长可保存 20 天）； 

2. 第二瓶：1L 免疫细胞无血清培养基中加入剩余 500ul NK-3。 

第二部分 脐带血/外周血采集 

脐带血 

1. 临床获得健康新生儿脐带血 100ml 以上（不含抗凝剂）。（首选肝素钠抗凝剂） 

2. 请保证血液在安全无菌且温度为 20-30℃条件下平稳运送至实验室。 

3. 新鲜脐带血 CBMC 最佳分离时间为取血后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务 必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。 

外周血

1. 使用一次性负压采血管抽取自体外周血 50-70ml。（首选肝素钠抗凝剂） 

2. 请保证血液在安全无菌且温度为 20-30℃条件下平稳运送至实验室。 

3. 新鲜血液 PBMC 最佳分离时间为取血后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必 于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。 

操作释义： 1. 肝素钠抗凝剂的必要性：由于血浆中的纤维蛋白原活化成有活性的纤维蛋白，纤维蛋白 交联成纤维蛋白血凝块，易使 CBMC 形成细胞团块，不利于细胞的活化。肝素钠抗凝剂可减 轻上述情况发生几率。 2. 运输条件需保持常温状态（20℃-30℃），严禁冷藏冷冻运输及长期放置（4 小时以上）， 尽量平稳送至实验室，减少不必要的摇晃震动。低温、震荡或长期放置会导致红细胞破裂， 血液理化性质发生改变，严重影响 CBMC 分离效果及细胞健康状态。 

第三部分 NK 细胞的活化及培养流程（2.5L 体系） 

第 0 天： 

1. 取出 2-4 支高效离心管，分别加入 16 ml 样本密度分离液，200g 离心 1min，确保离心后 隔片下充满分离液，隔片上有 0.5-25px 高度分离液。小心将 15-25ml 抗凝血缓慢沿管壁加至 分离液界面上，确保血液与分离液之间有明显界面（每管可加 15-25ml 血液，若血量超过 25ml，则分管操作）。20-30℃环境下，离心力 600g，离心 30min（也可根据实际情况进行 调节），注意离心机速度为慢升慢降。 

2. 离心后可观察从上至下分为 4 层，淡黄色血浆层，白色环状 P/CBMC 层，分离液层，红 细胞层。用吸管吸取最上层淡黄色血浆（每 50-60ml 抗凝血约可获得 20-25ml 血浆），放置 于无菌离心管中做灭活处理。 操作注意： 吸取血浆层时，吸管头请从上至下吸取，吸取至距离白色环状 P/CBMC 约 2mm 处时即可。如 过分贴近 P/CBMC 层，可能造成 P/CBMC 的损失。 

血浆的灭活步骤： 

1） 首先将含血浆的离心管置于水浴锅中 56℃ 静置 30min；

2） 接着放置于-20℃环境下静置 10min； 

3） 最后 1200g，离心 15min； 

4） 保存离心后的上清至一支新的无菌离心管中，弃去底部沉淀； 

5） 取出第 0 天所需 10ml 血浆备用； 

6） 剩余血浆建议在第3天补液前进行3次-80℃ ~ 37℃环境的反复冻融；3次冻融后1200g， 离心 15min；弃去底部沉淀，于 4℃保存离心后的灭活血浆。（此步骤目的为尽量多的去除 血浆中残留的纤维蛋白原，客户可根据自身需求选择性进行。） 




3. P/CBMC 洗涤：用吸管吸取 P/CBMC 细胞层至 50ml 离心管中，为尽量获得更多细胞，建议隔片以上部分全部吸取，注意不要吸到红细胞。在 P/CBMC 离心管中加入 PBS 混匀（PBS 与 P/CBMC 体积至少为 1:1，或加入的 PBS 体积大于 P/CBMC 体积），600g，离心 10min。 弃去上清，加入 PBS 重悬洗涤，300g，离心 10min。 操作注意： 细胞每一次洗涤都会有相应损失，请客户酌情处理。离心有两种损失，第一种是机械损伤细 胞，第二种是离心后上清液中有悬浮细胞。损失量约在 5%-15%之间，建议第一次洗涤前进 行细胞计数，如细胞数量过少，则酌情减少洗涤次数，但至少要洗涤 1 次。 4. 分离出的 P/CBMC 用未加入任何因子的基础培养基 配制成细胞悬液 50ml，加入一 整支“NK-1”，将上述所有液体转移至 T175 培养瓶中，加入 10ml 灭活血浆，置于饱 和湿度、37℃、5.0% CO2培养箱中培养，期间不要移动培养瓶。 操作注意： 1. 建议接种前计数，记录 P/CBMC 投入数量，以便后续实验步骤的分析调整； 2. P/CBMC 建议接种密度为 1.5-3×10 6个/ml，如分离后细胞数少，则相对应减少培养基的 量，但血浆及活化因子添加量不变； 3. 培养期间培养瓶盖需拧松至可透气且不掉落的状态，约 0.5-1 圈（无论使用的是否为透 气瓶，均拧松瓶盖。） 4. 建议使用纯度为 99.99% CO2气体。

第 3 天： 加入 50ml 活化培养基，加入 5ml 灭活血浆。 

第 5 天： 加入 100ml 活化培养基，加入 5ml（少于 5ml 则全部加入）灭活血浆。（放入培养 箱时，将培养瓶口垫高，至液体不会从瓶口溢出并拧松培养瓶盖） 

第 7 天：（开始计数） 将培养瓶中贴壁的细胞充分吹打下来，转移到 1 个细胞培养袋内（产品货号：N2500TBD） 加入 5ml 灭活血浆（少于 5ml 则全部加入），视细胞生长状态（计数），建议向培养 袋补加 300ml 活化培养基。 第 9 天： 视细胞生长状态（计数），建议向培养袋补加 500ml 增殖培养基，加入剩余灭活血浆。 




请客户于培养的第 7 天及后续补液日仔细阅读以下操作释义： 

一. NK 细胞培养中判断补液的标准是周期还是浓度： 

NK 培养一般来说是按照浓度进行补液，由于个体差异问题，每个样本生长状况不可能 100%相同，按照天数来补液会有一些不准确，所以按照浓度是相对稳妥的。添加培养基的时 间不一定要严格按照后期时间进行，根据具体情况具体分析，确保细胞已经活化成功，呈现 聚团生长的情况，细胞数量有增殖。在补加培养基后，脐带血/外周血细胞密度至少维持在 1-2×10 6个/ml，有利于细胞的生长。 

二. 关于培养密度及何时补液的问题： 1. 脐带血/外周血 NK 细胞培养的最佳密度为 100 万个/ml~300 万个/ml。 2. 当细胞密度增殖到 200 万-300 万个/ml 之间，根据公式：当前细胞总量（单位个）÷ 100 万个 - 现有体积（ml）= 本次需补加培养基体积（ml），将补液后的细胞密度控制在 100-200 万个/ml。一般每隔 48 小时计数补液一次，直到培养基完全用光。

3. 如计数后发现当前细胞密度达不到 200 万个/ml，建议 48 小时后再计数，细胞状态不好 或有凋亡现象，立即补加 5ml 灭活人脐带血血浆。 

三. 关于 NK 细胞在培养过程中的结团问题： 1. 一般情况下，NK 细胞培养期间有结团现象是正常的，由于血浆中有不可避免纤维蛋白存 在，容易造成细胞聚团或呈现絮状。经过反复吹打或摇晃可散开呈小团状为正常现象。 2. 使用的脐带血不够新鲜，有肉眼可见或不可见的凝血现象； 3. 密度过大； 4. 染菌，细胞死亡，纤维相互交缠； 5. 未及时补液，细胞缺乏营养，死细胞抱团。 

四. 为什么我的 NK 细胞长的慢甚至不长？ 1. NK 细胞占淋巴细胞比例，若低于 5%，细胞呈缓慢生长或停滞增殖状态； 2. 供血人的身体情况是否健康，无急慢性病，无不良生活习惯，无特殊身体状况； 3. 血液新鲜度（以外周血/脐带血离体 4 小时为判断，4 小时内为新鲜，4 小时以上为不新 鲜）； 4. 试剂盒、培养液、分离液的保存温度各不相同，请放置在适宜环境下； 5. P/CBMC 投入密度需达标，至少为 100-150 万个/ml，推荐为 150 万-300 万个/ml 之间； 6. 补液时机准确，培养液呈现橘色，且计数达标后进行补液，过早或过多补液都会造成细 胞不增殖或者少增殖； 7. 接种前 3 天，不要移动培养瓶； 8. 培养环境要稳定，温湿度适宜，CO2气体纯度 99.99%最佳，非必要不反复开关门。 9. 不论使用的是否为透气培养瓶，都要拧松瓶盖进行气体交换，只依靠透气膜的交换是远 远不够的。 

第 11 天： 

视细胞生长状态（计数），建议补加增殖培养基 500ml。 

第 13 天：

视细胞生长状态（计数），建议补加增殖培养基 500ml。此时取样做细菌、真菌、支原体、 内毒素检测。 

第 15 天： 

视细胞生长状态（计数），建议补加增殖培养基 500ml。 

第 17 天： 

收集 NK 细胞悬液 2500ml，400g×10min 离心后弃去上清液，250ml 离心管集 2 管每管生理 盐水 200ml 洗涤（1500rpm×8min）1 次，再用 50ml 离心管生理盐水 100ml 洗涤（400g×10min） 1 次，按照 200ml 生理盐水+ 8ml 20%人血清白蛋白重悬细胞，封装好后送至使用部门，同 时留样封存以备日后检测。 




【 注 意 事 项 】 1. 使用前请仔细阅读本试剂盒说明书，并严格按照说明书执行操作。 2. 本试剂盒必须按规定温度保存，不可反复冻融。试剂在使用前需常温解冻，并充分混匀， 不可剧烈震荡。 3. 可视细胞生长的实际状况适当调整补液时间和用量。