使用昆虫细胞培养大规模生产重组蛋白和生物农药的一个问题是CO2积累。本研究探讨了CO2浓度升高对昆虫细胞生长和代谢的影响。草地贪夜蛾Sf-9昆虫细胞在20%的空气饱和度、27℃和pH为6.2的条件下生长。通过在培养基中通入CO2和顶部通气，将细胞置于恒定的CO2浓度下培养。Sf-9细胞的倍增时间（PDT）随着CO2浓度的增加而增加。具体而言，0-37、73、147、183和220 mm Hg CO2浓度的PDT分别为23.2± 6.7、32.4± 7.2、38.1±13.3、42.9 ± 5.4和69.3± 35.9 h（n ＝ 3或4，95%置信水平）。在所有实验中，细胞的活率都在90%以上，即，虽然增加的CO2浓度抑制了细胞生长，但不影响细胞的活率。所有生物反应器实验的渗透压浓度均为300–360 mOsm/kg，已知该范围对昆虫细胞培养的影响可忽略不计。CO2浓度升高不会显著改变细胞特定葡萄糖消耗率（2.5–3.2 ×10-17 mol/cells），但会使特定乳酸生成率从3.0×10-19略微增加到10.2 ×10-19 mol/ cells。介绍
近年来，昆虫细胞培养的重要性迅速增长，因为它能够利用昆虫细胞培养生产杆状病毒生物农药和重组蛋白。这些产品的大规模生产涉及具有大工作体积的高细胞密度生物反应器，导致CO2在生物反应器内积累到抑制水平。此外，在大型生物反应器中，表面积体积比随着生物反应器尺寸的增加而降低，从而加剧了CO2在生物反应器内的积累。当CO2在生物反应器中积累时，它溶解在细胞培养基中并进入细胞质（即，CO2自由穿过细胞膜），在那里分解成HCO3-和H+（等式1）。
使用亨利定律，Sperandio和Paul给出的方程，并假设培养基离子强度为0.35M（对应于昆虫细胞培养基的渗透压为0.35M），CO2在昆虫细胞培养液中的溶解度可以估计为25.0mm Hg/mm。正常细胞生长通常需要的CO2浓度为30–50 mm Hg，而高于100 mm Hg的CO2浓度会抑制细胞生长和生产力。对CHO、杂交瘤和BHK细胞进行的大量研究表明，CO2积累会降低细胞生长、活率和产物形成。然而，很少有研究调查CO2浓度升高对昆虫细胞的影响。在杆状病毒感染的Sf-9细胞中，150 L生物反应器中产生的重组蛋白量仅为70 mL转瓶中产生重组蛋白量的30%，这被认为是由于CO2积累造成的。然而，没有进行实际的二氧化碳测量，但一个数学模型预测二氧化碳水平达到114 mm Hg的峰值。在100 mL转瓶中进行的实验表明，与0%CO2的产量相比，15% CO2的β-gal和TGFβ重组蛋白的产量分别减少了39%和56%。此外，在15%的CO2环境中，由于细胞死亡较慢，蛋白质产量增加。据推测，这是由于细胞代谢抑制导致的感染过程延迟。在1.5L生物反应器中，用顶部通气将溶解的CO2浓度从600 mm Hg降低到75 mm Hg，将Sf-9和Tn-5细胞的平均倍增时间（PDT）分别从38小时降低到22小时和46小时降低到22小时，并将Sf-9细胞的最大活细胞密度从5–6增加到8–10×106，将Tn-5细胞的最大活细胞密度从3–5增加到8-10×106 cells/mL。然而，所进行的CO2测量可能并不精确，因为在从生物反应器转移样品进行测量的过程中，一些CO2可能已经挥发。细胞培养基中CO2溶解产生的HCO3－和为控制细胞外pH（pHe）而加入的碱（如KOH）可以提高培养基的渗透压。已经在哺乳动物细胞中进行了几项研究，以确定升高的CO2和渗透压对细胞生长和生产力的综合影响。然而，昆虫细胞通常对250至400mOsm/kg的中等渗透压不敏感。因此，增加的渗透压不太可能抑制昆虫细胞的生长。本研究研究了CO2浓度对未感染昆虫细胞生长和代谢的影响。先前研究工作中的一些局限性，如用血气分析仪测量样品中的CO2浓度或基于传质方程估计CO2浓度，已经通过在配备高压灭菌CO2电极的受控生物反应器中进行所有实验来克服。结果和讨论
CO2对Sf-9细胞生长的影响
在摇瓶中生长的细胞的PDT是24.9±3.1小时（n＝7），与在维持在0–37 mm Hg的生物反应器中生长的细胞的PDT相似（即23.2±6.7小时，n＝3）。这些结果类似于Mitchell Logean和Murhammer的结果，其中生物反应器顶部通气导致Sf-9细胞的平均PDT为22小时。图1显示了Sf-9细胞在不同CO2浓度下的生长曲线。PDT值是用t检验计算的95%置信水平报告的。CO2浓度从0–37增加到183 mm Hg，PDT从23.2 ± 6.7 h（n＝3）逐渐增加到43.0±5.4 h（n＝3），之后CO2浓度增加到220 mm Hg，使PDT增加到71.0±24.7 h（n＝5）（图2）。在95%置信水平下使用Q检验法消除220 mm Hg PDT的显著误差的尝试没有成功。
图1：在控制良好的生物反应器中，Sf-9细胞在不同CO2浓度下的生长曲线。
图2: 在控制良好的生物反应器中，Sf-9细胞在不同CO2浓度下的倍增时间（PDT）。误差条表示95%的置信水平（n＝3–7）。摇瓶实验的PDT由w表示，误差条表示95%的置信水平（n＝7）。
增加CO2浓度不影响Sf-9细胞的活率。在所有实验中观察到Sf-9细胞的活率都超过90%。这些结果与Mitchell Logean和Murhammer以及Zhu等人的结果一致。他们分别报告了升高的CO2浓度不影响Sf-9和CHO细胞的活率。相反，Gray等人观察到，由于CO2浓度从35 mm Hg增加到148 mm Hg时，CHO细胞活率下降了27%。CO2对培养基渗透压的影响
在生物反应器和摇瓶实验中都观察到渗透压浓度从360 mOsm/kg下降到300 mOsm/kg。然而该范围内渗透压对昆虫细胞培养物的影响可以忽略不计；因此，Sf-9细胞生长的减少可能主要是由于CO2抑制，而不是培养基渗透压的改变。此外，渗透压下降的趋势不会随着不同的CO2浓度而改变，因此CO2浓度的增加不会显著影响Sf-9细胞培养基的渗透压。
CO2对Sf-9细胞代谢的影响
测定了在不同CO2浓度下控制的摇瓶和生物反应器中生长的Sf-9细胞的特定葡萄糖消耗率（表1）。据观察，暴露于不同CO2浓度的Sf-9细胞的特定葡萄糖消耗率变化不大。此外，在摇瓶中生长的Sf-9细胞的葡萄糖消耗率（2.6×10-17 mol/cells）与在不同CO2浓度（2.5–3.2×10-17mol/cells）的生物反应器中生长的Sf-9细胞的葡萄糖消费率相似。这些结果与Rhiel等人的结果一致。他们报告了未感染的Sf-9细胞的特定葡萄糖消耗率为2.4×10-17mol/细胞。
表1:暴露于不同CO2浓度的Sf-9细胞的倍增时间、特定葡萄糖消耗率和特定乳酸生产率
计算了暴露于不同CO2浓度下的摇瓶和生物反应器中生长的Sf-9细胞的特定乳酸生产速率（表1）。Tn-5细胞在未感染和感染的细胞中分别以5.8和2.6×10-17mol/cells的速率产生乳酸，与此不同，当存在足够的溶解氧时，Sf-9细胞不产生乳酸。然而，随着CO2浓度的增加，在未感染的Sf-9细胞中观察到特定乳酸的产生显著增加（表1和图3）。在摇瓶中生长的细胞和在控制在0–37 mm Hg CO2的生物反应器中生长的细胞消耗了最初存在于细胞培养基中的乳酸，在这些条件下没有产生乳酸。相反，随着CO2浓度从0–37增加到220 mm Hg，乳酸产量从3.0增加到10.2×10-19mol/cells。乳酸生成增加的一个可能原因是TCA循环的抑制。即使细胞外pH得到控制，细胞内pH也可能由于CO2积累而降低。这种细胞内pH值的变化可能抑制了TCA循环酶的活性，从而导致乳酸积累。结论
CO2浓度的增加导致未感染的Sf-9细胞中的细胞生长减少和PDT增加。CO2浓度升高不会显著改变细胞活率、培养基渗透压或特定葡萄糖消耗率。然而，CO2浓度的增加导致未感染的Sf-9细胞中乳酸的产生增加。
参考文献：Effect of CO2 on Uninfected Sf-9 Cell Growth and Metabolism
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