简介
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞主要用于单克隆抗体（mAb）和其他生物制品。这些药物广泛用于癌症治疗、自身免疫性疾病或其他疾病，这类药物由于其独特的分子结构和可变的空间折叠，是一个非常复杂的分子。CHO细胞能够表达复杂的糖基化和翻译后修饰的目的蛋白，这是它们与其他宿主（如酵母、细菌）相比的主要优势。单克隆抗体在工业上的开发通常从广泛的细胞克隆筛选实验开始，以选择最佳的克隆，进一步的开发侧重于通过调整培养基和补料成分以及设置适当的工艺参数（如pH和温度）来提高细胞性能，如生产力、产品质量、产品稳定性，这也是未来生物工艺开发的一个目标。CHO的培养可分为三个阶段。在培养的前几天，会进入一个指数生长阶段，高速细胞生长以及高葡萄糖和氨基酸（AA）消耗。细胞代谢的增加导致乳酸和氨的加速产生。在达到peak VCD（活细胞密度）后，细胞生长明显变缓，而mAb产量增加。在这个阶段，葡萄糖和氨基酸的产生减少，乳酸被重新代谢，氨的产生变缓。在细胞衰亡期，细胞活率开始下降；然而，mAb的产生持续存在。氨基酸（AA）是关键的细胞代谢产物和蛋白质的主要单位。大量研究表明，单一或几种氨基酸的限制会导致mRNA加工受阻、细胞生长停滞和产物氨基酸序列的变化。氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸，尽管非必需氨基酸可以由细胞产生，但它们通常存在于培养基和补料中，以支持细胞生长和生产力。生物制药工业中使用的培养基和补料主要以含有高氨基酸浓度的方式设计，然而，一些氨基酸的限制和消耗仍然可能发生。在CHO细胞培养过程中，天冬酰胺（asn）、天冬氨酸（asp）、半胱氨酸（cys）、谷氨酸（glu）、甘氨酸（gly）、组氨酸（his）、赖氨酸（lys）、苯丙氨酸（phe）、丝氨酸（ser）、苏氨酸（thr）和色氨酸（trp）的耗竭。有大量文献报道，补充氨基酸可以提高细胞活率和滴度（表1）。表1中通过补充缺失的氨基酸来优化当前的工艺。表1：实验方案和研究目的
结果和讨论
对于每种氨基酸，通过补料添加的量与参考过程中指数生长阶段（第0天-第5天）的平均氨基酸消耗量相匹配。谷氨酸和天冬氨酸不包括在补料设计中，因为它们的溶解度低，在细胞衰亡期积累，而且它们被归类为非必需的。在培养的前10天，分析显示，整体活细胞密度（IVCC）（图1a）、VCD峰值、活率趋势（图1b）、mAb产生（图1d）和葡萄糖、氨和乳酸的比速率的过程相似。通过添加贫瘠氨基酸和改变葡萄糖浓度，我们能够触发不同的细胞反应。计算细胞衰亡期必需氨基酸和非必需氨基酸的比摄取率。图1：工艺性能指标，包括IVCC、活率、渗透压和mAb浓度
对照工艺中的细胞代谢、生长和mAb产生（工艺A）
图1b显示活率超过90%，直到第10天开始下降。最终活率和密度分别为64.20±2.26%和7.11±0.24 x 106 cells/mL。在温度降低后向平稳期过渡的过程中，细胞生长和代谢显著降低。乳酸在指数期达到峰值，并在接下来的几天培养中被重新代谢。氨产量在指数阶段很高，主要是由于氨基酸消耗量高。在进入平稳期后，氨的产生停止，并保持恒定在9.45±0.11 mmol/L。从第5天起，mAb的产生开始增加，最终浓度为4.00±0.01 g/L或总计40.00±0.10 g。尽管补料1和补料2添加了氨基酸，但我们确定在细胞衰亡期asn、asp、cys、glu、gly、his、phe、ser、lys、thr、trp的消耗。几种氨基酸的限制可能对细胞生长和生产力产生不利影响；然而，最令人担忧的是一些必需氨基酸（如his、lys、phe和thr）的耗竭，这些氨基酸在细胞生长和mAb产生中起着重要作用。
添加氨基酸补料对细胞代谢、生长和mAb生产的影响（工艺B）
为了评估添加氨基酸和克服氨基酸消耗的效果，我们为工艺B制备了补料3。使用氨基酸补料，我们能够克服氨基酸消耗。提供的丰富氨基酸和高葡萄糖浓度（高于55.51 mmol/L）促进了细胞代谢，这从葡萄糖消耗和乳酸生产的增加中可以明显看出。升高的乳酸浓度（高于100 mmol/L）开始酸化细胞培养物，这导致NaOH的添加增加。因此，渗透压增加到612±15 mosm/kg，与对照工艺相比明显更高。高渗透压浓度加上乳酸的毒性水平导致接近工艺结束时活率（细胞裂解）和VCD急剧下降。mAb的生产停止（图1d）。渗透压浓度增加到440 mOsm/kg以上，乳酸的比生产率也增加了40%以上，这证实了我们的观察结果。ala、asp和gly积累的增加很可能导致细胞衰亡阶段氨的减少。mAb的产生趋势与对照工艺相似，直到第14天停止，并以3.39±0.45 g/L结束。总mAb量为39.50±5.24 g，与对照工艺相当。
添加氨基酸补料（缺乏丝氨酸）对细胞代谢、生长和mAb产生的影响（工艺C）
据文献报道，丝氨酸是CHO细胞消耗最多的氨基酸之一。它被转化为丙酮酸，从而直接为细胞代谢提供能量。因此，我们将丝氨酸从氨基酸补料中排除。在工艺C中使用补料来研究是否可以避免代谢增强，并观察其他添加的氨基酸对CHO细胞的影响。通过补料和流加策略，我们能够克服靶向氨基酸的消耗。
葡萄糖降低对细胞代谢、生长和mAb产生的影响（工艺D）
为了缓解丝氨酸增加导致的乳酸增加，我们限制了葡萄糖浓度以避免葡萄糖积累。其他文献也报道了CHO细胞在葡萄糖较少的培养基中产生较少的乳酸，这延长了细胞活率和mAb的产生。在添加氨基酸补料（包括丝氨酸）以及降低葡萄糖浓度之前，我们评估了葡萄糖降低对CHO细胞过程性能的影响。以下实验被命名为工艺D，其中与对照工艺的唯一区别是在细胞培养物中保持葡萄糖浓度<5.55 mmol/L。
葡萄糖和氨基酸补料（包括丝氨酸）减少对细胞代谢、生长和mAb产生的影响（工艺E）
在工艺E中，我们应用葡萄糖连续添加以保持葡萄糖浓度低于5.55mmol/L，类似于工艺D，并添加包括丝氨酸的氨基酸补料。我们想确定丝氨酸在低葡萄糖浓度下是否仍能促进细胞代谢，以及氨基酸是否能如其他报道的那样提高mAb的产生。通过氨基酸添加和补料策略，我们能够克服靶向氨基酸的消耗。
结论
在我们的工作中，我们观察到在用于mAb生产的工业CHO工艺中几种氨基酸的消耗，尽管它们是与补料一起添加的。我们设计了一种新的氨基酸补料来克服消耗并优化现有的CHO工艺。在细胞衰亡期，丰富的丝氨酸和葡萄糖促进了细胞代谢，导致乳酸浓度增加，从而降低了细胞活率和mAb的产生。通过丝氨酸排除，我们能够防止代谢增强，并提高活率；然而，mAb的产生没有显著增加。补充丝氨酸增加了乳酸的产生。保持低乳酸的另一种方法是在这个过程中限制葡萄糖浓度。在最终工艺中，我们结合了有限的葡萄糖补加和氨基酸补料添加（包括丝氨酸），这导致了最终工艺细胞活率、最终mAb量（超过25%）和工艺时间的增加。细胞代谢的变化通常会调节mAb的糖基化模式，这也在这项工作中观察到。生物仿制药开发过程中产品质量的变化至关重要，需要额外的工艺调整才能达到目标产品质量。结果清楚地表明，补料优化和适应性可以提高CHO的性能，延长补料分批工艺，但产品质量也会受到影响。了解细胞代谢对工艺开发至关重要，这证明了在工业上进行额外研究的合理性，所收集的知识可能是制药公司的巨大资产。
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参考文献：The effect of amino acid supplementation in an industrial CHO process 。
