如何提高CHO瞬转蛋白产量-宥艺新品发布

重组蛋白被广泛用于科研、药物研发、疾病诊断和治疗，具有非常重要的商业价值。稳定表达细胞的建立通常需要4-5个月，而蛋白的瞬时表达只需要7-14d，因此蛋白瞬时表达技术被广泛使用。

目前大分子生物医药新项目几乎都是用CHO细胞作为宿主细胞进行表达生产，基于一致性的考虑，前端研发部分更倾向于使用CHO细胞作为宿主细胞进行瞬转表达mg到g级的蛋白用于前期成药性研究等。但由于CHO细胞自身的原因导致采用化转的效率非常低，因此市场目前主流是电转或脂质体转染（赛默飞）。但电转操作复杂，并且无法大体积使用，使其使用收到一定程度的限制。赛默飞的脂质体转染操作简单，效果非常优异，但价格非常昂贵，也进一步限制了其使用。目前国内培养基公司推出的多数产品在CHO细胞瞬转上效果总体较差，需要很长的培养时间（比如12天）才能达到200mg/L。当然国产友商中也有性能优异的产品，但价格也是非常昂贵，因此亟需性价比高的CHO瞬转产品的出现。

提高瞬转表达量的办法

1 质粒载体的优化

动物细胞表达质粒的构成一般包括启动子元件、增强子元件、加poly(A）信号以及用于复制和选择的元件。由于瞬时转染系统所需的质粒，需要在大肠杆菌中进行扩增，其质粒构成要包含原核DNA复制起始区域（ORI）和抗生素筛选标记（氨苄霉素、卡那霉素等）。真核转录调控需要转录启动子整合复杂的信号，所以启动子在整合和转录信号加工过程中发挥关键作用。Durocher等人将来自pAdCMV5的编码CMV5-poly（A）表达盒的BglII片段连接到BglII线性化的pCEP4中，产生了新的载体pCEP5，并通过该载体使分泌型碱性磷酸酶（secretory alkaline phosphatase, SEAP）表达量分别提高了10倍。Kunaparaju R等人使用Epstein-Barr病毒的EBNA-1和OriP编码DNA序列来补充PyOri载体转染 Epi-CHO细胞，延长CHO细胞中的转基因表达，成功提高了蛋白的表达。

2 培养基的优化

培养基的成分复杂，对HEK293细胞的生长及表达有显著的影响，一款好的培养基是保证瞬转高效的重要因素。

（1）微量金属离子：培养基优化通常集中在氨基酸和碳水化合物浓度以及补充维生素和核苷酸水平。某些微量元素的组成和浓度可能对细胞的生长和生产力有关键影响。微量金属与超过1000种蛋白质相关，一些微量元素，比如硒、锌和铜已被广泛研究。硒通过参与谷胱甘肽氧化反应来抗氧化。锌参与细胞分化、凋亡和细胞增殖。缺乏锌的大鼠胶质瘤细胞生长速度下降，补充锌后生长速度恢复。锌可以通过保护细胞免受自由基损伤来促进细胞活力，并已被证明可以抑制Caspase-3依赖性凋亡。铜在多种重要酶中发挥着作用，包括细胞色素c氧化酶、酪氨酸酶、对羟基苯丙酮酸水解酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酸氧化酶和铜/锌超氧化酶歧化酶（SOD），这些酶参与了细胞生长和维持的过程。缺铜会降低细胞产生SOD的能力，从而降低细胞的抗氧化防御能力，从而增加细胞对氧化性DNA损伤的易感性。铁对维持健康细胞的生长至关重要。Zhang等人发现柠檬酸铁铵对GS-CHO细胞生长影响不大，但显著增加了蛋白表达 。Jacobia的研究表明微量元素优化在多种创新培养基配方中的好处。

（2）其他因子的添加：一些化合物也显示出对瞬转表达的积极影响。这些转染增强剂要么促进PEI/DNA转染复合物进入细胞或细胞核，要么增加基因表达水平。为了在表达实验中进一步增强蛋白表达水平，可以在表达培养基中添加丁酸钠或丙戊酸等小分子。有研究表明在无血清悬浮培养的293细胞中添加20 mmol/L醋酸锂、3.36 mmol/L丙戊酸和5.04 mmol/L咖啡因后用PEI介导进行瞬时转染，病毒样颗粒（VLPs）产量增加3.8倍，同时保持细胞培养活力在94%。 当在转染后3h后添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂时，HEK293E细胞的瞬时抗体产量增加了4-5倍以上，结合丙戊酸处理和低温培养，重组抗体产量从40mg/L提升至超90mg/L。

乙醇胺、腐胺、脂质混合物、氯化胆碱、d-泛酸钙和丙酮酸钠可能对细胞生长有促进作用。然而，其他物质，如亚硒酸钠、抗坏血酸、谷胱甘肽、核黄素和肌醇，被认为是抑制细胞生长的物质。

3 瞬转工艺的优化

瞬转试剂、细胞密度、DNA浓度、PEI与DNA的比例等都会对瞬转效率有很大的影响。

由于瞬时表达不整合到细胞染色体上,理论上来说起始的细胞浓度高会使得蛋白的表达量高,但细胞吸收DNA有一定的饱和性。DNA与PEI比例影响DNA/PEI复合物的性质,进而影响其进入细胞的途径。一般认为,在PEI比例较高的情况下,DNA/PEI复合物的结构更加紧密,并且可提高复合物的正电性,使其更容易进入细胞内,可避免复合物在细胞溶酶体内的降解，但PEI较高有一定的细胞毒性，影响细胞活率。

对于许多转染试剂，谨慎选择混合和孵育的时间对瞬转效率至关重要。用PEI瞬转时PEI/DNA复合物的大小及其孵育时间对于瞬转的效率有着很大的影响，在LV和AAV瞬转时中，500-700 nm 的最佳转染复合物下，LV和 AAV收获滴度最高^[66]。在DNA/PEI复合物孵育时间对293T瞬时转染蛋白表达的影响中，293T细胞瞬转时，蛋白滴度（mg/L）随PEI/DNA复合物孵育时间（0 ~ 44 min）的增加而增加。

Thompson等人对细胞密度4-18×10⁶的范围进行瞬时转染的研究，结果表明低细胞密度导致游离PEI浓度变高，增加了对细胞的毒性，导致细胞活率产物产量降低。典型的瞬转建议转染时的细胞培养密度为1×10⁶个/mL。最近的研究进展是寻找通过高密度培养进行瞬时表达的方法，以增加参与表达的细胞数量，从而提高蛋白质产量，高度富集的培养基配方和更高性能的转染试剂支持在2.5×10⁶个/mL的培养密度下转染，结果蛋白产量比当前使用1×10⁶个/mL的瞬时表达系统高2-10倍。在2L生物反应器中建立293 EBNA1细胞的高密度灌注培养，以PEI为DNA载体，在DNA含量为6 mg/10⁷个细胞、DNA：PEI比例为1:3的优化条件下，以细胞密度为1×10⁷个/mL进行转染。在转染后阶段，采用补料分批培养模式，在转染后5天获得80.8 mg/L的人促红细胞生成素（EPO），这也是首个报导的1×10⁷个/mL的密度下瞬转的实验。

4 培养工艺的优化

优化培养条件是提高CHO瞬转表达的重要方法。通常包括培养温度、补料工艺等方法。

（1）温度对于瞬转的影响： CHO细胞，通常在37℃培养，将培养温度降至32℃，降低温度可以提高细胞活率，延长培养时间，同时也能降低DNA的降解速率，从而提高蛋白的表达。

（2）补料对于瞬转的影响: 为了避免有限的营养浓度或过量的代谢副产物积累（如氨和乳酸盐），大多数提高瞬转生产力的尝试都集中在培养基配方和补料策略的开发上。补料分批工艺因其操作简便、实施灵活、与大规模生产兼容等优点，已成为治疗性蛋白和重组蛋白的主要生产技术。

对比HEK 293 EBNA1细胞补料分批培养与批培养，补料分批培养比批培养的重组蛋白总产量增加了165%。Kiseljak 等人通过补料分批培养将 HEK293EBNA 大规模瞬时转染表达重组蛋白产量提高到2g/L。Napoleone等人通过对补料工艺优化，HEK293细胞密度达到20×10⁶个/mL，抗体滴度比相应批次培养高3倍。

宥艺推出CHO瞬转全流程解决方案

上海宥艺生物科技有限公司研发团队通过深入研究及测试推出的两款媲美电转的化转试剂盒。

简易版本

简易版本的表达量可以达到电转的表达量或进口品牌脂质体转染的70%及以上，培养7天的平均表达量超过300mg/L；该版本的优势的操作极其简单，非常适合前期研究或规模化生产

表1 简易版本产品信息 

使用优势：无需离心，转染试剂也无需和质粒进行敷育，极大提高操作的便利性。

加强版本

  加强版本的表达量可以超过电转的表达量或进口品牌脂质体转染，该版本操作与常规化转一致，无需离心，但转染试剂需要和质粒进行敷育，适合难表达或对表达量有较大需求的客户。

表2 加强版本产品信息

使用优势：无需离心，表达量较高。

部分测试数据

图1. 1和4是PEI转染，2和3是宥艺转染全解决方案，5-7是进口品牌脂质体转染

图2. 1和2是宥艺转染全解决方案，3-5是进口品牌脂质体转染

图3. 1和2是宥艺转染全解决方案，3-5是进口品牌脂质体转染

表3. 宥艺转染全解决方案与电转多项目对比

关注宥艺生物微信公众号：欢迎咨询宥艺产品，宥艺生物将免费提供测试产品。

关于宥艺生物

上海宥艺生物科技有限公司是一家专注于提供化学成分限定商业化培养基、客户定制化培养基的研发及生产，培养基配方开发及优化服务的高科技生物技术公司。涵盖CHO细胞培养基、HEK293培养基、Vero细胞培养基、昆虫细胞培养基、杂交瘤培养基，T及NK细胞培养基和干细胞培养基等。致力于解决未被满足的培养基市场需求及拓展培养基应用领域，经过2年的研发已经建立完善的6大培养基产品线：

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