浅析培养基成分对细胞代谢和产品质量的影响

培养基决定着细胞的生长环境和理化特性，能够影响细胞的代谢、结构和表型稳定性。针对常规单抗项目，细胞株和培养基是决定蛋白产量与质量的两个最重要的因素；当细胞株确定后，需根据细胞株自身特性和项目要求，选择合适的培养基。无论是批次补料培养，还是灌流培养，培养基对产品的质量和产量都有举足轻重的影响。

培养基的发展历史

1882年，林格发明了林格溶液，这是一种成份接近体液的平衡盐溶液，可以使新解剖的心脏在其中保持跳动。在此之后，平衡盐溶液相继被开发出来，比如洛克溶液等。1907年，Ross G. Harrison发现淋巴液可以维持纤维细胞在体外生长几周，从此开启了细胞的体外培养时代。1913年，Alexis Carrel在血浆的基础上添加了胚胎提取物，使得细胞生长时间延长。由于血浆、淋巴液等成份不是非常明确，科学家们开始探究影响细胞生长的关键成份，研究发现糖和氨基酸是细胞生长的必须物质，通过透析血浆发现血浆里的低分子量物质也是必须的。Whit发现了更多细胞培养液的必须成份，开发了含有56种成份的F10培养基。后来，科学家们向培养基中添加血清，开发了最低必需培养基，如MEM、DMEM等。鉴于血清自身存在的稳定性较差、外源性物质污染等风险，CMRL公司研制出一种化学限定培养基CMRL1066；同时期，NCTC109、MB 752/1被开发出来，但是这几种培养基只适合小鼠淋巴细胞（L细胞）培养。直到1963年，Ham开发了第一个完全合成的适用于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生长的培养基Hams F12。不同时期出现的培养基及其特征可参考引用文献^[1]。随着抗体时代的到来，针对提高细胞密度和蛋白产量的化学限定培养基被逐渐开发出来。

培养基的分类

从功能上，培养基可以分为基础培养基、补料培养基、冻存培养基以及转染培养基等；基础培养基用于细胞复苏、生长和表达；补料培养基一般是浓缩培养基，用于蛋白生产过程中营养的补充、延长培养时间和提高产量等；冻存培养基主要用于细胞的冻存过程，其中含有一定冻存保护剂；转染培养基一般为减血清培养基，主要用于细胞转染。

培养基的成份及其作用

培养基主要包括水、碳源、氮源、维生素、脂类和微量元素等成份。

水是培养基中含量最多、细胞最敏感的成份，培养基配制用水应该符合《中国药典》2020年版四部中注射水或纯化水的标准，其中有机碳含量（TOC）不高于0.5mg/L（通则0682），电导率需满足通则0681的规定。此外，培养基配制过程中水的温度也应加以控制，若温度较高，培养基的成份容易变质失效，若温度较低，则影响培养基的溶解性。培养基易受周围环境污染，导致内毒素增高，因此培养基一般是现用现配。碳源主要用于维持细胞生命和支持细胞生长，主要包括碳水化合物如糖类、谷氨酰胺等。六碳糖可以被细胞高效利用，葡萄糖作为六碳糖的一种，是培养基中的主要碳源。每个细胞每天对葡萄糖的需求量约为1~10pmol，葡萄糖含量过低可能导致糖蛋白合成异常，如异常前体抗体的产生、蛋白质的附着、糖基化位点改变等。葡萄糖代谢过程如图1所示，主要是通过糖酵解产生丙酮酸，丙酮酸进入三羧酸（TCA）循环，从而产生能量^[2]。在糖酵解的过程中，75%~80%的丙酮酸会产生乳酸，乳酸积累会影响细胞生长、蛋白表达、产品质量如糖基化修饰等，另外乳酸的积累还会使培养体系pH下降，需补加碱液以维持细胞生长所需pH，进而使得培养体系渗透压增加。控制葡萄糖的消耗速率是降低乳酸积累的最有效途径，主要从两个方面实现：一方面是降低培养体系中的葡萄糖浓度，使细胞在低糖浓度下生长，通过补料的方式补加葡萄糖可以控制培养体系的糖浓度；另一方面是采用其它碳源替代葡萄糖，例如果糖、半乳糖和甘露糖，果糖吸收速率过慢，代谢通量低，可以与葡萄糖一起使用；代谢流分析实验表明在两者都存在的情况下细胞会优先消耗葡萄糖，这有利于减少乳酸形成，同时增加乳酸消耗；半乳糖和甘露糖会对产物的糖基化产生影响，使用时应该慎重考虑。培养基中若缺乏葡萄糖会导致UDP-GlcNAc的可用性降低，从而改变抗体的糖基化修饰。糖化是蛋白翻译后修饰的一种，对蛋白的异质性、稳定性和生物学活性等方面产生影响，葡萄糖浓度是影响单克隆抗体糖化程度和糖化速率的主要因素，在细胞培养后期降低葡萄糖浓度，能够有效减少单抗的糖化水平。

另一重要能量来源是谷氨酰胺，其作用是改善细胞活力、减少乳酸生成以及提高蛋白生产率等。培养体系若缺乏谷氨酰胺，轻则会使细胞的对数生长期延迟，重则会使细胞停止生长。每个细胞每天对谷氨酰胺的需求量约1~5pmol。谷氨酰胺的代谢途径如图2所示，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用发生脱酰胺作用，生成谷氨酸，谷氨酸继续脱酰胺基生成α-酮戊二酸，进入三羧酸循环参加多条代谢途径，一方面完全氧化生成二氧化碳，另一方面不完全氧化生成乳酸；谷氨酸的消耗也会产生氨，氨浓度的增加会改变电化学梯度并使细胞内环境酸化，从而破坏酶活性导致细胞凋亡^[3]。使用谷氨酰胺的替代物可以减少副产物的产生，比如谷氨酰胺基二肽、谷氨酸以及谷氨酰胺的衍生物等^[4]。此外，谷氨酰胺容易自发降解，有研究报道，在37℃下，谷氨酰胺在2~3天可以完全降解，在冷藏温度下保存6个月后，谷氨酰胺会降解约30%^[5]。为了解决谷氨酰胺降解的问题，商业化培养基特别是液体培养基一般不添加谷氨酰胺，需要在使用前添加，谷氨酰胺的添加浓度一般为4~6mM。谷氨酰胺不仅影响细胞的生长代谢，也会影响抗体的糖基化修饰，在一些项目中，谷氨酰胺浓度的增加会引起G0F比例增加和G1F/G2F比例降低，以及总的半乳糖化率降低。

氮源的主要来源是氨基酸，氨基酸的主要作用有以下几个方面：一、提高蛋白产量和最高细胞密度；二、消除或减轻氨和CO₂积累以及高渗透压下产生的副作用，如苏氨酸、脯氨酸等；三、作为信号分子，调控细胞凋亡。氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸，其分类见图3A，必需氨基酸是指细胞无法自身合成，需要外源摄入；非必需氨基酸细胞自身可以合成，尽管如此，有的非必需氨基酸仍需要外源摄入，比如谷氨酰胺，CHO细胞内源性谷氨酰胺酶的活性较低，无法满足细胞所需，因此需在培养基中添加一定量的谷氨酰胺以维持细胞生长。氨基酸的代谢过程如图3B所示，氨基酸通过分解代谢生成TCA循环的中间产物，进而进入TCA循环^[6]。另外色氨酸等一些氨基酸遇光和热易分解，培养基应该在避光、低温条件下保存。若氨基酸缺少则会使产物的错配率增加；当氨基酸浓度过量时，就会产生氨等副产物，这些副产物的积累对细胞生长是不利的，比如天冬氨酸的消耗会加速细胞的死亡、丙氨酸的代谢产物会增加氨的积累以及抑制TCA循环、赖氨酸浓度过量会增加细胞凋亡速率等^[7]。氨基酸不仅影响细胞生长，对产品质量也有贡献，比如半胱氨酸会减少抗体碎片的产生。控制这些氨基酸的浓度，可以减少中间体副产物的产生、改善细胞生长以及增加蛋白产量。在化学限定的培养基中，应该基于对细胞株的研究，控制好初始氨基酸的浓度，并根据细胞不同阶段的需求，补加一定量的氨基酸。

维生素是维持细胞正常生理状态的生物活性物质，对细胞代谢有着重要作用。细胞对维生素的需求量很少，但是细胞培养中若缺乏则会损害能量代谢和生物合成功能，若过量则限制细胞生长。许多维生素易受热、强光和长期空气暴露的影响，抗坏血酸和生育酚对空气氧化敏感、维生素B1，核黄素，钴胺素和抗坏血酸对光敏感、维生素B1和泛酸对热敏感。因此，在培养基储存期间保护培养基免受光和热的影响至关重要。维生素一般作为浓缩补料添加至培养基中，在细胞中大多形成辅酶或酶的辅基（即与蛋白质结合）参与细胞的代谢活动，例如泛酸可以在细胞内转变成酰基载体蛋白和辅酶，参与糖类、脂类和蛋白质代谢中的催化反应等，在培养基中添加生物类黄酮可以减少单抗的酸性变异体。脂类是细胞生物膜的主要成份，也可以作为能量来源和信号分子。包括磷脂、固醇、激素以及维生素D类等。脂类的水溶性较差，且容易被氧化，若在培养基中添加和优化脂类，需要关注脂类的溶解性以及带来的氧化应激作用，脂类一般是一次性加入培养基中。脂类的添加可以有效地提高细胞的生产率，最常加入培养基中的脂肪酸有亚油酸、亚麻酸，花生四烯酸、棕榈酸、棕榈油酸和肉豆蔻酸等。金属离子和微量元素是细胞维持生命活动不可缺少的营养成分，对细胞生长、代谢和产品质量有着重要的影响。部分金属离子对细胞代谢的影响见表1。钠离子（Na⁺）主要是维持体系的渗透压和pH。铜离子（Cu²⁺）作为培养基中重要的氧化剂，不仅对C末端降解、唾液酸含量等抗体质量有影响，还会影响乳酸的消耗^[4]。在细胞培养过程中，Cu²⁺浓度的升高会导致脯氨酸酰胺化、C端赖氨酸异构体增加，从而增加产品的酸碱变异体。化学限定培养基中不含蛋白质或多肽，因此需要胰岛素的替代物，适当浓度的锌盐已被证明是一种胰岛素类似物，可阻止细胞的凋亡^[8]。锰离子（Mn²⁺）作为一系列糖基转移酶的重要辅因子，在抗体的糖基化过程中具有关键作用，改变培养基中锰离子浓度可以通过影响核苷酸前体水平从而影响抗体的糖基化修饰^[9]，另外在常规项目中，Mn²⁺可以降低聚集体的产生。还应该指出的是，若金属离子的浓度超出了生物利用度，它们可以催化自氧化并导致活性氧（ROS）的产生，这将不利于细胞的生长，因此，在使用金属离子以调控产物质量时，应控制其浓度。金属离子的吸收利用会相互干扰，如细胞培养基中过高的钙离子浓度会影响镁和锌的吸收和利用，所以培养基中需保持离子浓度的平衡。

培养基中还含有其他成份，如细胞保护剂，用于保护细胞免受渗透压变化、剪切力、氧化及气泡作用等引起的损伤，常用的保护剂种类有血清、白蛋白、非离子性表面活性剂PluronicF68等。
总结

随着生物医药行业的不断发展，哺乳动物细胞培养工艺研究备受关注，培养基作为工艺开发的基石，了解其成份和作用尤为重要。可根据细胞的种类和特性研究其生长、代谢和表达过程中所需的营养物质和限制因子，进而实现细胞培养工艺的稳健性，达到批间产量、质量的一致性。

以上文章来源于Cell Culture