本文围绕CHO细胞培养过程中影响IgG糖型形成的主要工艺参数进行讨论，重点分析温度、pH、溶氧（DO）、渗透压以及化学添加剂对糖型结构的影响、作用机制及相关文献数据。系统分析不同工艺参数对IgG糖型的影响规律，以用于指导建立稳定可控的抗体生产工艺。

1 . 引言

随着抗体工程技术和生物制药产业的快速发展，单克隆抗体已广泛应用于肿瘤、自身免疫疾病及感染性疾病治疗。IgG类抗体Fc区N-糖基化是一种重要的翻译后修饰形式，同时也是影响治疗性单克隆抗体的生物学功能、稳定性、免疫原性和体内半衰期的关键质量属性(CQA)。Fc区糖链结构不仅影响抗体空间构象，还能够调节Fcγ受体结合能力，从而影响ADCC及CDC活性。

IgG抗体Fc区的N-糖基化位点位于Asn297，其糖链结构主要包括高甘露糖型、半乳糖化型、岩藻糖化型及唾液酸化型等。不同糖型对应不同的生物学功能，如去岩藻糖化能够增强FcγRIIIa结合能力，提高ADCC活性；半乳糖化能够增强补体激活能力；唾液酸化则与抗炎活性相关；高甘露糖聚糖可以提高血清清除率。

2 . 影响IgG糖型因素

CHO细胞由于具备接近人源化的糖基化修饰能力、较高的表达稳定性及成熟的工业化培养体系，成为当前最广泛应用的抗体表达系统。然而，CHO细胞产生的糖型具有明显异质性，如宿主细胞系选择、细胞培养条件和营养供应等因素可显著影响糖基化模式。

CHO细胞中的糖基化过程主要发生于内质网与高尔基体中，涉及糖基转移酶、核苷酸糖供体以及细胞能量代谢等多个过程。工艺参数变化能够通过影响细胞代谢、酶活性、分泌通路及糖前体供应等途径改变最终糖型结构，因此生产过程中控制条件的变化很可能导致聚糖组成/结构的异质性。

近年来多篇文献报道发现，温度、pH、溶氧、渗透压以及化学添加剂等工艺参数均能够不同程度改变IgG Fc区糖型分布，从而改变产品质量属性。英国曼彻斯特大学研究者（PMID：41833362）采用索引期刊数据库（例如 Scopus、Web of Science、PubMed、Wiley Online Library 和 Google Scholar）方法，检索范围为2010年至2024年发表的记录，筛选出39篇符合研究工艺参数影响糖型标准的文章进行统计分析。对各个文献报道数据采用聚糖分布法和聚糖指数（GIx）法进行归一化分析，其中聚糖分布是指各个糖型的相对丰度以百分比分布（如G0F所占百分比）；聚糖指数（GIx）是量化了特定单糖（通常是岩藻糖、半乳糖和/或 NeuAc）在整体聚糖分布中的净糖占有率，如GI（半乳糖化）、FI（岩藻糖化）和SI（唾液酸化）指数。

3 . 温度对CHO细胞IgG糖型的影响

温度是影响CHO细胞糖型形成的重要工艺参数之一。工业化培养过程中通常采用37 ℃培养，而低温培养（30~33 ℃）或降温策略已广泛应用于提高蛋白表达稳定性及产品质量。

分析表明，降低培养温度可能会影响半乳糖和岩藻糖的净含量，从而影响生物活性。在9个案例研究中，有1例显示 GIx 增加了 ≥ 10% ；有3例GIx降低≥10% ；只有1项研究显示大幅下降；其他大多数报告半乳糖净含量变化极小，唾液酸化通常保持不变。通常低温培养能够显著影响IgG Fc区半乳糖化水平，如37 ℃降低至32 ℃后，FA2G1与FA2G2比例增加，而FA2G0下降，表明低温有助于提高糖链加工完整性。文献中报道低温条件下半乳糖化指数（GI）变化可超过10%，属于影响最显著的工艺参数之一。

温度对GIx的影响可能源于温度降低引发的多种细胞反应。降低培养温度可以减少细胞代谢、细胞增殖以及核苷酸糖供体转运蛋白和糖基转移酶的表达，还会减缓除重组单抗以外的内源性蛋白质的分泌，可能减少对细胞资源的竞争。然而，通常在较低温度下观察到的比生产率(Qp) 的增加会缩短单抗在分泌途径中的停留时间，尤其是在聚糖前体供应有限的情况下。然而，也有研究指出过低温度可能导致糖链加工不完全，产生更多高甘露糖型结构。这说明温度调控具有明显的范围依赖性。总体而言，温度是目前对CHO细胞IgG糖型影响最显著且最易工业化实施的工艺参数之一。

4 . pH对CHO细胞IgG糖型的影响

pH是CHO细胞培养过程中的关键控制参数，通常维持在7.0左右。培养过程中一般通过CO₂通气及碱液（例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠）补加进行pH调控。

pH 值偏离基线后，没有出现一致的反应。在某些情况下，pH > 7.0 会导致聚糖异质性增加，而在另一些情况下，则会导致聚糖异质性降低。将 pH 值降低至7.0以下，导致 GI 值增加 2.32%，SI 值降低 0.7%，而 pH值高于7.0时影响甚微。然而，即使对于同一产品和细胞系，这些相互矛盾的观察结果也使得建立一个描述 pH 值对糖基化影响的通用框架变得复杂。在 GIx 发生变化的情况下，这种变化主要体现在半乳糖上，且 ∆GIx 小于 10%。因此pH变化对糖型的影响整体较小，但不同研究之间存在明显差异。

其机制主要与高尔基体腔内环境变化有关。低pH条件下，细胞内外质子浓度变化可能破坏高尔基体pH梯度，影响糖基转移酶活性。同时，pH变化还可能改变囊泡运输速度，使蛋白在分泌通路中的停留时间发生变化，从而影响糖链成熟程度。
文献数据显示，pH变化导致的ΔGI通常低于5%，明显低于温度及渗透压的影响。因此，目前普遍认为pH对糖型的影响具有较强的工艺依赖性与细胞系依赖性，其调控规律尚未完全统一。

5.  DO对CHO细胞IgG糖型的影响

溶解氧（DO）是维持CHO细胞有氧代谢的重要参数，工业培养中DO通常控制在20%~50%。氧气传递取决于气体流速、入口气体中的氧分压、气泡大小、搅拌速率和通气设计。低DO水平可诱发缺氧，而高DO水平则可导致氧化应激和活性氧的产生，这两种情况都会损害细胞生长、细胞存活、单克隆抗体生产和产品质量。

只有少数研究系统地调查了不同DO对糖基化的影响。多数研究认为DO对IgG糖型影响较弱（∆GIx < 1.0%）。部分文献报道在不同DO条件下，GI变化通常小于1%，说明CHO细胞对DO波动具有较强稳态调节能力。
DO影响糖型的潜在机制主要包括氧化应激、能量代谢变化及细胞膜转运变化等。高DO条件可能导致ROS积累，从而影响糖基转移酶活性；而低DO则可能改变细胞代谢流，影响核苷酸糖前体合成。尽管目前DO对糖型影响有限，但相关机制研究仍较少，尤其缺乏系统性的分子机制研究。因此，DO对糖型的调控规律仍需进一步深入研究。

当溶解氧控制在50%空气饱和度时，糖基化指数没有显著变化，半乳糖含量略有增加，∆GIx 为 2%–5%。然而，这些研究并未进行挑战性实验，即通过补充抗氧化剂来缓解高 DO 条件。为了减轻高溶解氧条件下的氧化应激，通常会在培养基中添加了抗氧化剂，如补充黄芩苷和S-磺基半胱氨酸（具有抗氧化特性的L-半胱氨酸类似物），以减少活性氧的产生并防止氧化损伤。

pCO₂也会影响细胞培养性能，这主要是通过其在pH值控制中的作用实现的。通常，哺乳动物细胞培养的CO₂浓度设定为5%，并根据需要进行调整以维持pH值。目前对CO2的影响的了解有限，部分原因是其变化间接影响 pH 等其他参数。研究表明，当pCO2到 5% 以上时，GI 略微降低 (<∆GIx 5%)，而不影响岩藻糖基化或唾液酸化。

6 . 渗透压对CHO细胞IgG糖型的影响

渗透压对细胞生长、活力和生产力至关重要，是影响CHO细胞培养状态的重要参数之一。哺乳动物细胞培养的典型渗透压值范围为280至320 mOsm/kg。在添加补料或积累副产物的培养基中，渗透压通常会升高，另外添加NaCl 或高浓度补料引起的高渗培养能够提高细胞比生产率（Qp），但同时也可能改变产品质量属性。

研究表明，渗透压属于对糖型影响较显著的工艺参数（ΔGI可达到10%左右），渗透压升高通常会导致GI下降（半乳糖水平，∆GIx降低约 10%），并降低FI（岩藻糖化水平，∆GIx 降低2-10%），从而对mAb的治疗功能产生强烈影响。例如当培养渗透压增加100~200 mOsm/kg后，FA2G0比例增加，而FA2G1和FA2G2下降，说明高渗环境会降低糖链加工完整性。但是不同研究间基线渗透压的差异使得直接比较变得复杂。

机理：其作用机制主要包括以下几个方面：第一，高渗环境可下调糖基转移酶表达；第二，高渗条件可能减少核苷酸糖供体供应；第三，高渗应激会改变细胞代谢状态，影响高尔基体糖加工效率。
虽然高渗培养能够提高抗体产量，但可能降低糖型质量，因此工业化生产中，尤其是在强化补料分批培养工艺中，需要在产量与质量之间进行平衡优化。

7 . 添加剂对CHO细胞IgG糖型的影响

为提高CHO细胞表达效率，可以添加多种分子来提高细胞Qp和产量，这些分子包括诱导细胞周期停滞的化学物质（CDK4/6抑制剂）、化学伴侣、内质网应激抑制剂、和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC，如丁酸钠或戊酸）等化学添加剂，通过诱导细胞周期阻滞、调节表观遗传水平或缓解ER应激提高蛋白表达。

研究表明，多数添加剂对糖型影响相对有限，在半乳糖基化含量方面，一半的案例中存在约6%的∆GIx 影响，其余案例中存在小于1.5% 的较小影响，并且不影响岩藻糖基化。

丁酸钠或戊酸：已知NaBu会改变糖基化途径中几个基因的表达，包括锰转运蛋白基因（slc39a8，糖基转移酶反应中的关键辅助因子），但这种效应的强度不足以显著改变mAb的糖基化。丙戊酸和戊酸影响糖基化的分子机制仍未阐明，预计与丁酸钠的机制类似。NaBu能够提高表达量，但其对GI及FI影响通常较小。部分研究发现，NaBu处理后FA2G0增加而FA2G1、FA2G2下降，但整体变化幅度有限。
CDK4/6抑制剂：可诱导CHO细胞G0/G1期阻滞，并增加半乳糖和岩藻糖的占有率（<∆GIx 2–5%）。

DMSO联合BIX处理：可发挥化学伴侣作用，同时减轻DMSO 诱导的内质网应激，从而增强 B4galt 表达并改善聚糖占有率 (GI ∆GIx <5% )。

Forskolin：可通过G0/G1 期阻滞和 Bcl-2 基因抑制增加Qp，尽管作者报道末端半乳糖基化增强，使用 GIx 方法评估时，该影响微乎其微。

然而，目前多数研究认为添加剂对糖型的影响具有明显的过程依赖性，添加化学化合物对产生mAb的CHO细胞培养物的影响高度依赖于培养工艺。需要进一步研究以阐明化学补充剂与聚糖结果之间的分子机制。
此外，工业生产中还需考虑大规模生产成本高昂、添加剂残留风险、下游纯化难度及监管要求，制造商通常会避免使用此类添加剂，除非它们能显著提高生产效率。随着细胞系开发和生物工艺优化的不断进步，对这些添加剂的需求有所下降，从而限制了它们在商业应用中的使用。

7.  总结与讨论

总体来看，作者对历史文献统计分析，得出结论：不同工艺参数对CHO细胞IgG糖型的影响程度存在明显差异。其中，温度与渗透压对糖型影响最显著，可明显改变半乳糖化及岩藻糖化水平；pH与DO影响相对较小，但具有明显工艺依赖性；化学添加剂虽然能够提高表达量，但对糖型改善作用有限。
上述工艺参数影响糖型的分析范围限定于抗体。其他表达系统和产品类型不在研究范围内。目前关于CHO细胞糖型调控的研究也存在若干问题：①不同研究采用的糖型分析方法及评价指标缺乏统一标准，导致研究间可比性不足；②当前多数研究仍停留于现象描述阶段，且通常仅探索狭窄或异质的工艺参数范围，缺乏系统性的分子机制研究；③放大生产条件下糖型稳定性研究仍相对不足，下游影响（例如，添加剂残留、杂质谱）也未进行常规量化；④培养系统（包括生物反应器配置、过程控制策略、传感器技术和PP测量方法和灵敏度）的差异会会导致不可忽略的不一致性。

基于文献数据总结可知，糖基化谱在不同的环境培养条件、CHO细胞系、培养方式以及产生的特定IgG之间表现出高度稳定性。因此仅工艺参数不足以可靠地引导糖基化朝着预期的方向发展。为了获得更理想的糖基化模式，需要采取其他辅助策略，例如优化培养基（如微量元素、核苷酸等）。未来，随着多组学分析、代谢流分析、人工智能及数字孪生技术的发展，精准糖型调控将成为生物制药工艺优化的重要方向。同时，结合培养基优化、过程控制（PAT）及糖工程技术，有望实现更稳定、更可控的抗体糖型生产。